Alternaria Nees (Ascomycota, Pleosporaceae) es un género fúngico ubicuo que incluye especies saprófitas, endófitas y patógenas (Woudenberg et al., 2013). Las especies fitopatógenas de este género afectan a una amplia variedad de cultivos ornamentales, hortícolas y frutales, y producen daños sobre órganos almacenados (Logrieco et al., 2009). En particular, la especie A. tenuissima ocasiona importantes pérdidas económicas en cultivos; por ejemplo, genera manchas foliares en amaranto (Amaranthus hybridus L.) y remolacha (Beta vulgaris L.), y causa pudrición de inflorescencias en brócoli (Brassica oleracea L.) (Blodgett & Swart, 2002; Fraire-Cordero et al., 2010; Khan et al., 2020). En postcosecha, es capaz de generar podredumbre seca del interior de la manzana [Malus x domestica (Borkh.)] y pudrición del tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.) (Kou et al., 2014; Liu et al., 2019), entre otros.

En agricultura convencional, la práctica más frecuente para controlar patógenos es la aplicación de fungicidas sintéticos. Sin embargo, es cada vez mayor la conciencia global sobre la necesidad de alternativas para un manejo fitosanitario de menor impacto ambiental, por los consabidos problemas que los agroquímicos ocasionan en la salud ambiental y humana (Sarandón & Flores, 2014; Zacker, 2016). En esta línea, algunos de los fungicidas recomendados para combatir alternariosis, como el mancozeb (ditiocarbamato) y el iprodione (dicarboximida), están siendo objeto de reevaluaciones de toxicidad debido a la creciente evidencia de su potencial como cancerígenos para los seres humanos. De hecho, recientemente la Unión Europea ha suspendido el uso del mancozeb y ha disminuido el límite máximo de residuos de iprodione permitido en los alimentos (EFSA, 2016; Cocco, 2022). Adicionalmente, el uso recurrente de estos compuestos ha derivado en el origen de cepas fitopatógenas resistentes (Tripathi & Dubey, 2004). Por lo expuesto, la posibilidad de recurrir a antifúngicos distintos a los convencionales resulta una alternativa interesante. Actualmente, los productos a base de extractos vegetales son una de las opciones más prometedoras que están siendo exploradas, ya que las plantas producen una amplia variedad de metabolitos secundarios que actúan como una defensa contra patógenos y herbívoros (Wittstock & Gershenzon, 2002). Además, la mayoría de estos compuestos no sólo son biodegradables y suelen ser de baja o nula toxicidad para mamíferos, sino que presentan una escasa probabilidad de desarrollar resistencia por parte de los organismos patógenos, debido a que no son específicos en su modo de acción (Tripathi & Dubey, 2004; Zacker, 2016).

El ricino (Ricinus communis L., Euphorbiaceae) es una planta arbórea, arbustiva o subarbustiva anual en zonas templadas y perenne en zonas tropicales y subtropicales, nativa del noreste de África, que ha sido introducida en gran parte del mundo y registrada como invasora, tanto en áreas silvestres como en cultivos. Sus hojas, largamente pecioladas, son suborbiculares con lóbulos acuminados. Florece en verano y fructifica en otoño (Dimitri, 1972; Subramaniyan, 2020). Se conocen diversos usos medicinales para el ricino desde tiempos antiguos. Su aceite, conocido como aceite de castor, se obtiene de las semillas y tiene una gran importancia terapéutica desde tiempos antiguos (Marwat et al., 2017; Subramaniyan, 2020). Sin embargo, las semillas de esta especie concentran una glicoproteína soluble en agua denominada ricina que es capaz de originar serias intoxicaciones por ingesta en los humanos y otros animales (Audi et al. 2005; Worbs et al., 2011; Moshiri et al., 2016), por lo que el uso de extractos de semillas para diversos fines debe manejarse con suma cautela. Las hojas también son empleadas en medicina popular en diversas preparaciones: infusiones para tratar dolores de estómago, aceite para calmar flatulencia en niños, o cataplasmas para curar llagas, forúnculos o hinchazones (Kumar, 2017; Elkousky et al., 2021). Estudios fitofarmacológicos revelaron la presencia de alcaloides (ricinina y N-dimetil-ricinina), monoterpenoides (β-thujona, 1,8-cineol, alcanfor, α-pineno), ácidos fenólicos (ácido gálico) y flavonoides (quercetina, kaempferol y sus glicoderivados) en las hojas de esta especie, todos metabolitos secundarios con potencial antimicrobiano (Kang et al., 1985; Jena & Gupta 2012; Ribeiro et al., 2016). Además, existen antecedente del efecto inhibitorio de extractos acuosos y etanólicos de hojas de ricino en el crecimiento de distintas especies de hongos fitopatógenos de los géneros Aspergillus, Candida y Fusarium (Siva et al., 2008; Jena & Gupta, 2012; Naz & Bano, 2012). Particularmente, Bayaso et al. (2013) y Kalpashree y Raveesha (2016) han observado reducciones significativas en el crecimiento de Alternaria solani (Ellis & G. Martin) L.R. Jones & Grout con extractos acuosos de la hoja de esta especie.

Este trabajo surge de una investigación sobre plantas tóxicas del partido de Vicente López (Argentina) enmarcada en la etnobotánica (Valerio et al., 2022). En dicho estudio, el ricino sobresalió como una de las especies más conocidas de la zona y de mayor consenso en cuanto a su potencial tóxico. Este hecho, sumado a los antecedentes referidos y a la abundancia de la especie en Vicente López debido a su carácter invasor, llevó a la realización del presente trabajo como parte de la instancia de “devolución a la sociedad”, común en las investigaciones etnobotánicas. En este sentido, se realizó un estudio del efecto de extractos de hojas de ricino sobre A. tennuisima, que es un fitopatógeno común en jardines y huertos, a fin de aportar a la identificación de especies de plantas que permitan la elaboración de preparados artesanales para combatirla. Así, el objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial inhibitorio de extractos acuosos y etanólicos de hojas de R. communis sobre el crecimiento de A. tenuissima.

Para llevar a cabo el ensayo, se emplearon hojas de ricino recolectadas de 3 ejemplares adultos localizados en zonas aledañas al Río de la Plata en la localidad de Vicente López (partido de Vicente López, Buenos Aires, Argentina). Las hojas se desinfectaron por medio del lavado con hipoclorito de sodio 2,5 g/l durante 5 min y se secaron a temperatura ambiente. Luego, fueron trituradas y tamizadas con una malla de 1 mm para descartar las partículas más finas. Posteriormente, el material se secó a 70°C hasta alcanzar un peso constante. Se tomaron fracciones de 15 g de material que se maceraron durante 24 h en: a) 100 ml de agua destilada estéril, b) 100 ml de etanol al 25%, c) 100 ml de etanol al 50%. Los extractos obtenidos se filtraron al vacío utilizando un filtro de celulosa Whatman N°1 y centrifugaron durante 10 minutos a 3.500 rpm (Roleo mod. 2036). El sobrenadante colectado (solución madre) se esterilizó utilizando filtros de inyección descartables de 0,2 µm (Sartorius).

En relación al patógeno vegetal, se utilizó una cepa fitopatógena de Alternaria tenuissima (INTA IF-531) aislada de manchas foliares de calibrachoa INTA 06575 (Calibrachoa hybrida Llave & Lex., Solanaceae), depositada en el cepario del Laboratorio de Sanidad del Instituto de Floricultura del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (Borrelli et al., 2018). El mantenimiento de la cepa se realizó en medio de cultivo extracto de malta 12,7%, glucosa 10% y agar 20% (MEA), a 4ºC.

Se evaluó la actividad antifúngica de los distintos extractos sobre A. tenuissima con la técnica del medio de cultivo envenenado (Balouiri et al., 2016). Para esto, se cultivó A. tenuissima en placas de Petri de 90 mm con 20 ml de MEA y 5 ml de los extractos al 100, 50, 25 y 12,5% (v/v). De esta forma, las concentraciones finales evaluadas para cada extracto fueron del 25, 12, 6 y 3%. Los controles negativos (0% de extracto) se realizaron reemplazando el volumen de cada extracto por los respectivos solventes de extracción. Como control positivo, se realizaron cultivos en MEA con el fungicida Rovral (iprodione 50% m/m) en una concentración final de principio activo de 0,05% m/v, en coincidencia con la concentración sugerida por el fabricante para su empleo en cultivo. Los medios envenenados fueron inoculados con discos de 4 mm de diámetro de cultivos de A. tenuissima en fase de crecimiento exponencial en MEA y se incubaron a 28ºC en condiciones de oscuridad. Se cuantificó el efecto antifúngico de los extractos en sus diferentes concentraciones como la diferencia entre las áreas colonizadas por A. tenuissima en el medio envenenado en relación a los controles negativos, al momento en el que en estos últimos las colonias del hongo alcanzaron el margen de las placas (8 días). El área de crecimiento se calculó analizando fotografías con el software ImageJ (US National Institutes of Health) (Schneider et al., 2012). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

El análisis estadístico de los tratamientos se realizó mediante ANOVA de un factor, previa comprobación de los supuestos de normalidad y homocedasticidad. El contraste de los tratamientos se efectuó a posteriori mediante test de Tukey. En ambos casos, el valor de significancia seleccionado fue de 0.05. Se utilizó el software R v.3.6.1. (R Core Team, 2019).

Todos los tratamientos con etanol inhibieron por completo el crecimiento de A. tenuissima, incluyendo a los controles negativos (Tabla 1). Debido a esto, no fue posible evaluar el efecto de los extractos obtenidos sobre el crecimiento fúngico de esta especie. Por su parte, el área de crecimiento registrada en el tratamiento con iprodione 0,05% m/v fue de 1,9 (±1,9) (Tabla 1 y Figura 1).

Tabla 1
Efecto sobre A. tenuissima del extracto acuoso de hojas de R. communis. % v/v (respecto del extracto concentrado). % m/v para el iprodione. **Los valores corresponden a la media de 3 réplicas ± error estándar. Letras diferentes denotan diferencias significativas (p<0,05) mediante Test de Tukey.

Figura 1
Cultivos de A. tenuissima a 8 días de la siembra en MEA suplementados con: A) etanol 25% (control negativo) ; B) etanol 50% (control negativo); C) iprodione 0,05% m/v (control positivo).

El análisis estadístico de los extractos acuosos de ricino evidenció un efecto de la variable concentración de extracto sobre el crecimiento fúngico (p<0.001) (ver Tabla 1 y Figura 2). Se observa una disminución significativa en el área colonizada por A. tenuissima en las distintas concentraciones de extracto con respecto al control negativo acuoso (test de Tukey, p<0.05) (Tabla 1). A su vez, el área colonizada en los medios con extracto al 6% difiere significativamente de aquellos con extracto al 3% y al 25% (p<0,05), pero no al 12%. Los medios con extracto al 12%, con un área colonizada similar a la del extracto al 25%, no presentaron diferencias con los demás tratamientos acuosos, a excepción del control negativo. Todos los tratamientos mencionados difirieron respecto al control positivo (ver Tabla 1).

Figura 2
Crecimiento de A. tenuissima a los 8 días desde la siembra en MEA en los distintos tratamientos acuosos: A) control negativo acuoso (0% extracto de ricino); B) 3% extracto de ricino; C) 6% extracto de ricino; D) 12% extracto de ricino; E) 25% extracto de ricino.

Los resultados obtenidos indican que las mezclas de etanol en agua al 25% y al 50% inhiben completamente el crecimiento de A. tenuissima. Por este motivo, no se pudo distinguir, y por lo tanto evaluar, los efectos de los extractos alcohólicos de hojas de ricino en dichos solventes. Al respecto, algunos autores han destacado que el efecto inhibitorio que es capaz de ocasionar el etanol sobre las células de los hongos se debe principalmente a su acción sobre la membrana plasmática, al modificar su estructura y de esta forma influir directamente sobre la asimilación de agua y nutrientes (Thomas & Rose, 1979; Dao & Dantigny, 2011). Sin embargo, las concentraciones mínimas inhibitorias del crecimiento varían de forma considerable entre distintas especies o cepas fúngicas (Dantigny et al., 2005). Para la cepa de A. tenuissima evaluada en este trabajo, el etanol en agua logró inhibir el crecimiento in vitro tanto o más que el iprodione, por lo que podría resultar una alternativa interesante a los fungicidas convencionales para el tratamiento de las enfermedades que causa este hongo en cultivos y frutos almacenados (USDA National Organic Program, 2001; Dao & Dantigny, 2011). Aun así, es necesario profundizar y ampliar los ensayos in vitro al respecto, por ejemplo, evaluando otras cepas y especies de Alternaria y analizando alteraciones morfológicas y de producción de conidios, así como evaluar la factibilidad del uso de etanol en los cultivos. Autores como Rowe et al. (1994) y Rajala et al. (1998) han ensayado la pulverización foliar en plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) hasta concentraciones de etanol del 20% (v/v), y en avena (Avena sativa L.) y nabo (Brassica rapa L.) hasta concentraciones del 40% (v/v), sin observar fitotoxicidad. Para avanzar sobre esta posibilidad, sería oportuno realizar estudios in vitro con otras cepas de A. tenuissima para determinar, por ejemplo, si el efecto de las mezclas etanol-agua no se debe a una hipersensibilidad de la cepa testeada; asimismo, sería conveniente ensayar concentraciones de etanol inferiores al 25%, a fin de determinar la mínima concentración inhibitoria del crecimiento, así como replicar el ensayo en condiciones in vivo, luego de inoculaciones en plantas.

En los tratamientos realizados con extractos acuosos de hojas de ricino, se observó que el crecimiento del patógeno alcanzó la máxima inhibición (55%) en la dilución al 6%, difiriendo significativamente de las demás concentraciones ensayadas (Tabla 1). Si bien la inhibición disminuyó con el extracto al 25% en relación con el 6%, se requerirían ensayos adicionales para discriminar si lo observado se debe, efectivamente, a un efecto biológico o a una limitante metodológica. Estos resultados son similares a los obtenidos por Bayaso et al. (2013) para Alternaria solani. En ese trabajo, los autores evaluaron el efecto de distintas diluciones obtenidas a partir de un extracto acuoso (40 g/100 ml) de tallo y hojas de R. communis sobre el crecimiento in vitro de A. solani, observando porcentajes de inhibición máximos del orden del 50%. Adicionalmente, Kalpashree y Raveesha (2016), en un estudio sobre el efecto de distintas concentraciones de extractos acuosos de 25 especies vegetales sobre el crecimiento de A. solani, registraron para las hojas de ricino el tercer porcentaje de inhibición más elevado (cercano a 70 %). Por su parte, se ha observado también que los extractos acuosos de hojas de ricino presentan efecto inhibitorio sobre Fusarium oxysporum f. sp. melongenae y F. oxysporum f. sp. cumini (Sharma & Trivedi, 2002; Siva et al., 2008). En esta línea, el presente trabajo amplía el conocimiento sobre el potencial inhibitorio de los extractos acuosos de hojas de ricino sobre el crecimiento de especies fitopatógenas del género Alternaria. Asimismo, incrementa el tipo y número de patógenos controlables con estos extractos.

Varios estudios indican que las hojas de ricino contienen sustancias solubles en agua, como alcaloides (ricinina y N-dimetil-ricinina), ácidos fenólicos (ácido gálico) y flavonoides (quercetina, kaempferol), los cuales presentan acción antifúngica (Calderón-Montano et al., 2011; Ghosh et al., 2013; Ibraheem & Maimako, 2014; Rampadarath et al., 2014; Ribeiro et al., 2016; Li et al., 2017; Nguyen & Bhattacharya, 2022). Esto podría explicar los resultados obtenidos en este trabajo con los extractos acuosos.

Por lo expuesto, y dado que el ricino es una especie de amplia distribución y abundancia en Vicente López, los extractos acuosos de sus hojas son una alternativa fitosanitaria prometedora para el tratamiento de enfermedades fúngicas, que podría ser empleada por los pobladores en sus huertos y jardines. Para esto, es necesario replicar el ensayo en condiciones in vivo, a fin de determinar las concentraciones de extracto efectivas, así como evaluar la potencial toxicidad de los macerados para los usuarios, animales y otros organismos, periodos de degradación y ecotoxicidad, entre otros aspectos.

En este trabajo se observó que los extractos acuosos de las hojas de R. communis presentaron efecto inhibitorio sobre el crecimiento de la cepa de A. tenuissima INTA IF-531. El efecto máximo fue del 55%, lo cual coincide con los hallazgos de un estudio similar llevado a cabo contra otra especie fitopatógena de Alternaria (A. solani). Por su parte, el etanol, tanto al 25 como al 50%, inhibió completamente el crecimiento del hongo, por lo que no fue posible evaluar el efecto de los extractos etanólicos de ricino. Si bien se requieren más ensayos in vitro e in vivo con esta y otras cepas de Alternaria, los resultados de este estudio muestran que tanto las mezclas etanol-agua como los extractos acuosos de hojas de ricino son alternativas prometedoras para la protección vegetal, evaluando previamente sus parámetros ecotoxicológicos.