Efecto de la sobreexpresión del cbm del gen de Expansina 1 (LEEXP1) de tomate sobre la calidad y el ablandamiento del fruto

Resumen

Uno de los principales factores determinantes de la calidad y vida poscosecha de un fruto es su firmeza. La misma está condicionada por varios factores, siendo uno de los principales la rigidez mecánica determinada por la pared celular [1].
Durante la maduración, intervienen numerosas enzimas y proteínas que degradan y remodelan la pared celular, y un aspecto común de la estructura de la mayoría de estas proteínas es su organización modular.
Incluyen, típicamente, un dominio catalítico característico de cada enzima y, uno o más dominios de unión a carbohidratos (CBM), unidos por una cadena poco estructurada. Un CBM se define como una secuencia contigua de aminoácidos dentro de una enzima activa sobre carbohidratos, que posee un plegamiento característico y la capacidad de unirse al sustrato [2], aunque carece de actividad enzimática.
En plantas, se ha informado la presencia de CBMs putativos en endoglucanasas [3,4] y también en expansinas [5]. Estas últimas, son proteínas carentes de actividad hidrolítica conocida, pero pueden provocar la extensión de paredes celulares aisladas, probablemente por su hipotética capacidad para romper interacciones no covalentes entre hemicelulosas y celulosa [6]. Asimismo, se ha postulado que su actividad
provoca una relajación en la estructura de la pared, facilitando el acceso de otras enzimas a sus sustratos [7]. En tomate, la sobreexpresión de LeExp1 provocó un mayor ablandamiento del fruto, mientras que la supresión del gen retrasó el ablandamiento [8].
De esta manera, surgió la idea de elaborar una estrategia que permita controlar la degradación de la pared celular y el ablandamiento de frutos, mediante la sobreexpresión de CBMs en la pared celular, empleando tomate como sistema modelo.
Se llevó a cabo el clonado de CBM-LeExp1 en tomate (Solanum lycopersicum var. Ailsa Craig). Para ello, se hizo uso del sistema Gateway®, usándose como vector de entrada al pDONR221 (Invitrogen).
El vector de destino seleccionado fue el pK7WG2D.1. El mismo es un vector binario y se utiliza para generar una sobreexpresión de la proteína de interés con un marcador visible de selección (GFP). Por transformación vía Agrobacterium tumefaciens y posterior cultivo in vitro
se generaron líneas transformantes (generación F0). Para la caracterización preliminar de los frutos (plantas F1), se cosecharon tomates de líneas transgénicas y controles en el estadío verde maduro y se realizó un ensayo poscosecha con los mismos. Se evaluó la coloración externa de los frutos con un colorímetro (Minolta CR300), y la firmeza empleando un texturómetro (TextureAnalyzer, TA.XTPlus) equipado con una sonda plana de 25 mm de diámetro. En este último ensayo, se registró la máxima fuerza desarrollada al comprimir el fruto
hasta provocar una deformación de 0,5mm [8].
Como conclusión preliminar, se puede mencionar que los resultados con los frutos han arrojado datos que muestran un aumento de la firmeza de los frutos sobreexpresantes respecto a los controles.